PhD-forsvar af Manos A. Papadakis

Bedømmelsesudvalg: Lektor Jette Thykær (formand), Professor Olaf Nielsen, Department of Biology, Functional genomics, Københavns Universitet, Professor Per Sunnerhagen, Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg, Sverige

Ordstyrer: Lektor Irene Kouskoumvekaki, DTU
Vejleder: Lektor Chris Workman, DTU

Løbende ændringer i miljøet udfordrer levende organismer i løbet af deres levetid. En celles overlevelse afhænger af dens evne til at koordinere et hurtigt og vellykket stressrespons, når den udsættes for akutte doser af skadelige stoffer. Oxidativt stress, forårsaget af et overskud af reaktive oxygenformer, beskadiggør cellulære komponenter. Hos mennesker er redox-ubalance forbundet med aldring, cancer, Alzheimers og Parkinsons sygdom blandt andre. Studier af cellulære mekanismer anvendt som reaktion på oxidativt stress er derfor markant forøget i de seneste år, især ved anvendelse af modelorganismer. Fissionsgæren Schizosaccharomyces pombe er en encellet eukaryot, der besidder genomiske træk og molekylære signaleringsveje, der er højst velbevarede i mennesker. En stor mængde stressresponsdata er allerede tilgængelig for denne gær og udgør et værdifuldt udgangspunkt for yderligere studier af genekspression under stress. Post-transkriptionel kontrol af genekspression er imidlertid mindre klarlagt.

     Vi var interesseret i at undersøge sammenhængen mellem mRNA og protein-ekspression og definere deres tidsdynamik under den oxidative stressrespons. Med udgangspunkt i denne målsætning, målte vi mRNA og protein-niveauer i prøver indsamlet fra eksponentielt voksende fissionsgærkulturer i en tidsserie efter cellulær behandling med hydrogenperoxid (HP). Det anvendte eksperimentelle design tillod os at måle både aktiveringen og genanvendelsesfaser af respons ved en tilstrækkelig høj tidsopløsning til at modellerer transkriptions- og translationsdynamik. Absolutte ekspressionsniveauer (kopier per celle) og tidsopløste ekspressionsprofiler for 4.972 mRNAer og 2.310 proteiner blev bestemt, og en webapplikation til profilvisualisering blev udviklet. Vi fandt en høj korrelation mellem mRNA og protein-niveauer. I de fleste tilfælde korrelerede en stigning i proteinkoncentration med transcriptionsinduktion, mens vi ikke fandt en korrelation mellem lavt-udtrykte proteiner og deres mRNA koncentration. Ændringer kun på mRNA niveau (formålsløs transskription) eller protein niveau (translationel regulering) var almindelige. For kontinuerligt inducerede proteiner blev tidspunktet for maksimale produktionsrate nået, når mRNA niveauerne toppede. Således var den maksimale nedbrydningshastighed for sammenhængende lavt-udtrykte proteiner ofte observeret ved tidspunktet for det minimale mRNA respons.

Ved brug af tidsopløste mRNA profiler fra lave og høje celledensitet populationer under stress fandt vi en tæt sammenhæng mellem celledensitet og HP udtømningshastighed, som således påvirker eksponeringstiden og mRNA responsdynamikken. Baseret på afhængigheden mellem responstider eller andre tidsdynamiske træk ved mRNA profiler af celledensitet definerede vi forskellige transkriptionelle responser. Vi observerede, at de fleste mRNAer udtrykt fra fællesregulerede gener under stress nåede tidspunktet for den maksimale (eller minimum) respons tidligere i kulturer med højere densitet. Lignende responsdynamik i høje og lave cellepopulationer blev ofte observeret. Endelig, centrale oxidative stress gener viste en positiv korrelation mellem responstid og celledensitet. Vi har også identificeret den hurtige respons af fissionsgærceller til oxidativt stress og vi fandt, at genfunktioner forbundet med cellulær redox homeostase og med cellens skæbne hurtigt bliver reguleret som reaktion på HP.

Desuden har vi karakteriseret gærcellers vækstfysiologi under flere betingelser for HP stress og løst individuelle vækstvariabler med høj præcision for hundredvis af segreganter i en high-throughput opsætning. Graden af den dosisafhængige, negative effekt på vækst af segreganter gærstammer blev observeret til at være ikke-trivielt relateret til stress fænotyper af de parentale stammer. Derfor kunne segreganterne grupperes efter omfanget af stresseffekter, de udøvede på hver vækstvariabel. Disse resultater er i øjeblikket under efterforskning i et større studie af kvantitative fænotypiske loci (QTL).